Wie es der Name schon andeutet, hat Amphotericin B amphotere Eigenschaften. So besteht es aus einem glykosidisch gebundenen Aminozucker und einem makrocyclischen Lactonring (hydrophil), der eine hydrophobe Seite, bestehend aus einer Kohlenwasserstoffkette mit vielen konjugierten Doppelbindungen (Polyen), hat. Über diese hydrophobe Seite, die in ihrer Struktur den Sterinen sehr ähnlich ist (starres, planares, hydrophobes, durchkonjugiertes Doppelbindungssystem etwa gleicher Länge), kann sich das Molekül an das Ergosterol in der Pilzzellmembran anlagern. Dabei treffen je nach Literatur bis zu acht Amphotericin B Moleküle aufeinander, welche eine Wasser-gefüllte Pore in der Membran hinterlassen. Durch diese Pore können Teilchen < 8 Angström (Ionen, Wasser aber keine Makromoleküle) die Zelle verlassen. Die betroffene Pilzzelle läuft sozusagen aus und geht daher zugrunde, womit Amphotericin B fungizid wirkt.
Da das Cholesterol der menschlichen Zellen dem Ergosterol der Pilze strukturell sehr ähnlich ist, kann sich das Amphotericin B auch an dieses anlagern. Aus diesem unspezifischen Mechanismus resultieren damit sowohl die Wirkungen als auch die Nebenwirkungen. Die Nebenwirkungen treten bei der oralen Gabe allerdings stark in den Hintergrund, da der Arzneistoff nur in sehr geringem Umfang resorbiert wird.
