Aciclovir ist ein Guanosin-Analogon, das auch als "Trojanisches Pferd" bezeichnet werden könnte. Um antiviral wirken zu können, muss es erst in das Triphosphat überführt werden. Der erste Schritt geschieht bevorzugt in mit Herpes-simplex-Viren oder mit Varicella-Zoster-Viren infizierten Zellen durch viruscodierte Thymidinkinasen, die es zum Monophosphat umwandeln. Die zwei weiteren Phosphorylierungen zum Aciclovir-Triphosphat geschehen durch wirtszelleigene Enzyme. In nicht-infizierten Zellen erfolgt die erste Phosphorylierung in nur sehr geringem Ausmaß, und auch Epstein-Barr-Viren und Cytomegalieviren codieren nicht für eine Thymidinkinase, weshalb ihre Emfindlichkeit gegenüber Aciclovir deutlich niedriger ist.
Das Aciclovir-Triphosphat wird von der DNA-Polymerase in die wachsende DNA-Kette eingebaut, wobei die Affinität zur viralen DNA-Polymerase um das 30-fache höher ist als zur wirtszelleigenen DNA-Polymerase. Der Einbau hat zur Folge, dass mit der acyclischen Seitenkette keine weiteren Nukleotide verknüpft werden können und die DNA-Polymerase dort fixiert bleibt, wodurch die Virusbiosynthese abbricht.
